فایل کامل و عالی بررسی متابولیسم داروی نوسکاپین در سلول های مجزای کبد موش

فهرست مطالب

چکیده پایان نامه
بخش اول: مقدمه
مقدمه   
۱-۱- اوپیوییدها   
۱-۱-۱- تاریخچه   
۱-۱-۲- آلکالوییدهای تریاک   
۱-۱-۳- پپتیدهای اوپیویید درون زاد   
۱-۱-۴- آثار اوپیوییدها بر اعضای مختلف   
۱-۱-۵- مصارف بالینی اوپیوییدها     
۱-۲- متابولیسم   
۱-۲-۱- تاریخچه   
۱-۲-۲- کلیات متابولیسم   
۱-۲-۳- مکان های متابولیسم داروها   
۱-۲-۴- عوامل تعیین کننده سرعت تغییر شکل زیستی   
۱-۲-۵- تکنیک های تجربی بررسی متابولیسم   
۱-۲-۶- کاربرد و اهمیت بررسی متابولیسم   
۱-۳- جداسازی سلولهای کبد   
۱-۴- روش های مطالعه شده برای شناسایی و اندازه گیری نوسکاپین و متابولیت هایش   
۱-۵- کلیاتی درباره کروماتوگرافی و HPLC   
۱-۵-۱- تاریخچه   
۱-۵-۲- اساس کروماتوگرافی   
۱-۵-۳- فازهای متحرک و ساکن در کروماتوگرافی مایع   
۱-۵-۴- کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا   
۱-۵-۵- اساس دستگاه HPLC   
۱-۶- نوسکاپین   
۱-۶-۱- برخی اثرات نوسکاپین   
۱-۶-۲- فارماکوکینتیک نوسکاپین   
۱-۶-۳- مروری بر روند متابولیسم نوسکاپین   
بخش دوم: روشها و مواد
۲-۱- اهداف مطالعه   
۲-۲- دستگاه ها و وسایل    
۲-۳- مواد   
۲-۴- تهیه بافرهای پرفیوژن   
۲-۴-۱- محلول Stock بافر هنکس با غلظت ۱۰ برابر   
۲-۴-۲- محلول Stock بافر کربس- هنزلیت با غلظت ۲ برابر   
۲-۴-۳- بافر هنکس یک   
۲-۴-۴- بافر هنکس دو   
۲-۴-۵- بافر کربس آلبومین   
۲-۴-۶- بافر کربس- هپس   
۲-۵- تهیه محلول کلاژن و کوت کردن پلیت ۶خانه   
۲-۶- محیط کشت   
۲-۶-۱- مراحل تهیه محیط کشت: (۱:۱) DMEM, F12   
۲-۷- سرم جنین گاو (FBS)   
۲-۸- کیت استریل پرفیوژن   
۲-۹- تهیه هپاتوسیت های تازه   
۲-۹-۱- نگهداری سلولهای به دست آمده از کبد موش   
۲-۹-۲- بررسی حیات سلولی و نحوه اثر دادن دارو روی سلولهای جدا شده از کبد موش   
۲-۹-۳- تهیه نمونه برای انجام آنالیز   
۲-۱۰- روش سنتز مکونین (۶ و ۷- دی متوکسی فتالید)   
۲-۱۱- دلایل انتخاب HPLC   
۲-۱۱-۱- مشخصات دستگاه HPLC   
۲-۱۱-۲- انواع روش های HPLC آزمایش شده   
۲-۱۱-۳- روش تهیه بافر ۱۰X استات با ۴ pH=   
۲-۱۱-۴- روش تهیه بافر فسفات سدیم Mm 25 با ۵/۴ pH=   
۲-۱۲- استخراج متابولیت از ادرار انسان   
بخش سوم: نتایج
۳-۱- جداسازی سلولهای کبد   
۳-۲- سنتز مکونین   
۳-۳- روش کروماتوگرافی با کارکرد عالی (HPLC)   
بخش چهارم: بحث و نتیجه گیری
۴-۱- جداسازی سلول های کبد موش   
۴-۲- روش کروماتوگرافی با کارکرد عالی (HPLC)   
۴-۳- متابولیسم نوسکاپین   
۴-۴- متابولیسم نوسکاپین در ادرار انسان   
خلاصه انگلیسی   
منابع   
اختصارات   
 
چکیده پایان نامه
اطلاع از مسیرهای متابولیسم دارو نقش مهمی در درک سمیت دارو دارد. این اطلاعات می توانند در طراحی داروهای جدید و روشن کردن مکانیسم سرطان زایی ترکیبات شیمیایی به کار روند. از
این رو یافتن روشی مناسب برای بررسی متابولیسم داروها گام مهمی در جهت رسیدن به دیگر اطلاعات  با ارزش در مورد داروها است. متابولیسم نوسکاپین در ادرار انسان، خرگوش و موش صحرایی بررسی شده است. طبق نتایج به دست آمده از این مطالعات نوسکاپین از دو مسیر o- دمتیلاسیون و شکسته شدن پیوند C1-9 متابولیزه می شود و مکونین به عنوان محصول عمده متابولیسم آن شناخته شده است. در این تحقیق متابولیسم نوسکاپین توسط یک روش ex vivo، سلولهای جدا شده کبدی، مورد بررسی قرار گرفت این روش از چند جنبه دارای اهمیت است: این روش حد واسط مناسبی بین روشهای قبلی مانند آنزیم های حل شده، فراکسیون ارگان جدا شده و مطالعه مستقیم روی حیوان کامل است. این سلولها خصوصیات لازم بافت دست نخورده مانند نفوذپذیری غشا را دارا هستند از این رو در بسیاری از مطالعات بیوشیمیایی به کار می روند.
در این تحقیق سلولهای کبد موش صحرایی طی یک فرآیند دقیق جدا شدند و زنده بودن آنها با آزمایش منع تریپان آبی %۱/۰ و مشاهده میکروسکوپی سلولها تأیید شد. شناسایی استاندارد داروی نوسکاپین و متابولیت اصلی آن، مکونین توسط روش HPLC صورت گرفت. اگر چه استانداردهای نوسکاپین و متابولیت اصلی آن در محلولهای Spike شده مشاهده شدند اما این روش قادر به شناسایی متابولیت ها در عصاره سلولی نبود. به نظر می رسد که افزایش حساسیت روش به مشاهده همزمان نوسکاپین و متابولیت ها کمک کند.
 
اختصارات
– ACEIS: Angiotensin Converting Enzyme Inhibitors
– BSA: Bovine Serum Albomin
-DMEM: Dulbecco”s Modified Eagle Medium
– DMSO: Dimethyl sulfoxide
EXP: Exposure
EXT: Extract
FBS: Fetal Bovine Serum
FCS: Fetal Calf Serum
HPLC: High Performance Liquid Chromatography
MTT: 3- [4, 5- Dimethylthiazol- 2- yl]- 2,5- diphenyl tetrazolium bromide
ml: milliLiter
mM: millimole
 : ug: Microgram
 : Microlitre
Rt = Retention time
SPE= Solid Phase Extraction
v = volume
w = weight

Information about pathways of drug metabolism has important role on understanding of the drug toxicity.

برای مشاهده محصول مشابه پیشنهاد می‌کنیم فایل کامل و عالی پایان نامه بررسی متابولیسم داروی نوسکاپین در سلولهای مجزای کبد موش را ببینید.

These informations can be used in design of new drugs and making clear understanding of carcinogenesis of chemical compositions. So that finding of suitable method in study of drug metabolism is an important step in finding other valuable information about drugs. noscapine metabolism has been investigated in human, rabbit and rat urine. According to these studies noscopine is metabolized in two pathways o-demethylation and C1-9 bond cleavage and meconine has been found as the major product of its metabolism. In this study noscapine metabolism was investigated by an ex vivo method, isolated hepatocyte. This method has several outstanding aspects, it is a suitable intermediate between pervious methods such as solubilized enzymes, isolated organelle fraction and direct study on whole animals. These cells have the essential properties of the intact tissue, including similar permeability characteristics, so that they can be used in many biochemical studies.
In this study rat hepatocytes were seprated in accurate process and their viability was confirmed by trypan blue 0.1% test and microscopic evaluation A method was developed for determination of noscapine standard and its major metabolite, meconine by HPLC. Although the standards of noscapine and its major metabolite were observed in spiked solutions but the method was not able to detect the metabolite in cell extract. It seems that the improvement in sensitivity of the detection method helps to observe the parent drug and metabolite simultaneously.

References

۱.    Katzung, B.G.  Basic and Clinical Pharmacology. (2004) 9th edition P: 51-64, 512-528.

۲.    Dewick, P.M., Medical Natural Products A Biosynthetic Approach. (2003) 2nd edition P: 329-331.

۳.    Evans, W.C. Trease and Evans, Pharmacognosy. (2002) 15th edition P: 357-358.

۴.    Cone, E.J.; Gorodetzky, C.W.; Shu Yuan Yeh; Darwin, W.D. and Buchwald, W.F. Determination and measurement of opium alkaloids and metabolites in urine of opium eaters by methane chemical ionization mass fragmentography. J. of chromatography. (1982) 230: 57-67.

۵.    متابولیسم داروها و مواد شیمیایی (بیوشیمی ترکیبات خارجی)؛ تألیف پارک د.و.، ترجمه آیینه چی ی. و محمودیان م.؛ ۱۳۶۰؛ ص ۸-۱۱.

۶.    Hasler, J.A. Pharmacogenetics of cytochromes P450. Mol Aspects Med. (1999) 20(1-2): 12-24, 25-137.

۷.    Hasler, J.A.; Estabrook, R.; Murray, M.; Pikuleva, I.; Waterman, M.; Capdevila, J.; Holla, V.; Helvig, C.; Falck, J. R.; Farrell, G.; Kaminsky, L.S.; Spivack, S.D.; Boitier, E. and Beaune, P. Human cytochromes P450. Mol Aspects Med. (1999) 20: 1-137.

۸.    Gondfriand, T.; Miller, R. and Wibo, M. Calcium antagonism and calcium entry blockade. Pharmacol. Rev. (1989) 38: 321-416.

۹.    Smith, D.A.; Abel, S.M.; Hyland, R. and Jones, B.C. Human cytochrome P450, electivity and measurement in vivo. Xenobiotica. (1998) 28(12): 1095-1128.

۱۰.    مطالعه فارماکوکینتیک مبودیپین و دیبودیپین، دو مسدد جدید کانال کلسیم، در حیوانات آزمایشگاهی؛ بهلولی ش. پایان نامه شماره ۱۲ گروه فارماکولوژی، دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی ایران؛ ۸۳-۱۳۸۲؛ ص ۲۷.

۱۱.    Moldeus, P.; Hogberg, J. and Orrenius, S. Isolation and use of Liver cells. Methods Enzymol. (1978) 52: 60-71.

۱۲.     Howard, R.B.; Christensen, A.K.; Gibbs, F.A. and Pesch, L.A.
J. Cell Biol. (1967) 35:675.

۱۳.     Berry, M.N. and Friend, D.S. J.Cell Biol. (1969) 43:506.

۱۴.    Wagle, S.R. and Ingebretsen, W.R., Jr, this series 35:579.

۱۵.     Seglen, P.O. Exp. Cell Res. (1973) 82:391.

۱۶.    Ian Freshney, R. Culture of Animal Cells A Manual of Basic Technique. (2000) 4th edition P: 96-98, 357-358.

۱۷.    روشهای بنیادی کشت یاخته های جانوری؛ خوانساری ن. و شمشیری م.؛ ۱۳۷۴؛ص ۱-۳۰.

۱۸.    Haikala, V. New sensitive method to determine noscapine in serum by reversed-phase liquid chromatography.
J. of Chromatography. (1985) 337: 429-433.

۱۹.     Jensen, K.M. Determination of noscapine in serum by high-performance liquid chromatography. J. of chromatography (1983) 274: 381-387.

۲۰.    کروماتوگرافی و طیف سنجی؛ شفیعی ع.؛ ۱۳۷۳؛ ص ۱-۷۹.

۲۱.    Hamilton, R.J. and Sewell, P.A. Introduction to High Performance Liquid Chromatography. (1981) 2nd edition P: 1-13, 60-78.

۲۲.    Ravindranath, B. Principles and Parctice of Chromatography. (1989) P: 23-53, 321-332.

۲۳.    Schwedt, G. Essential Guide to Analytical Chemistry. (1998) P: 142-147.

۲۴.    Willette, R.E. Textbook of Organic Medicinal and Pharmaceutical Chemistry. (1998) 10th edition P: 687-711.

۲۵.     Karlsson, M.O.; Dahlstrom, B.; Echernas, S.-A.; Johansson, M. and Tufvesson, A. Pharmacokinetics of oral noscapine.
 Eur. J. Clin. Pharmacol. (1990) 39: 275-279.

۲۶.     Dahlstrom, B.; Mellstrand, T.; Lofdahl, C.-G. and Johansson, M. Pharmakokinetic properties of noscapine. Eur. J. clin. Pharmacol. (1982) 22: 535-539.

۲۷.     Tsunoda, N. and Yoshimura, H. Metabolic fate of noscapine. II. Isolation and identification of novel metabolites produced by C-C bond cleavage. Xenobiotica (1979) 9(3): 181-187.

۲۸.     Mitchell, I.D.; Carlton, J.B.; Chan, M.Y.; Robinson, A. and underland, J. Noscapine-induced polyploidy in vitro. Mutagenesis. (1991) 6(6): 479-486.

۲۹.     Kamikawa, Y. and Shimo, Y. Inhibitory effects of non-narcotic antitussive drugs on cholinergically and non-cholinergically mediated neurogenic contractions of guinea-pig isolated bronchial muscle. J. Pharm. Pharmacol. (1991) 43(4): 242-246.

۳۰.     Mahmoudian, M. and Mojaverian, N. Effect of noscapine the antitussive opioid alkaloid on bradykinin-induced smooth muscle contraction in the isolated ileum of the guinea-pig.

۳۱.     Francel, P.C. Bradykinin and neuronal injury. J. Neurotrauma. (1992) 9 suppl. 1: 527-54. Review.
۳۲.     Ebrahimi S.A.; Zareie, M.R.; Rostami, P. and Mahmoudian M. Interaction of noscapine with the bradykinin mediation of the cough response. Acta Physiol. Hung. (2003) 90(2): 147-155.

۳۳.     Zhou, J.; Gupta, K.; Aggawal, S.; Aneja, R.; Chandra, R.; Panda, D and Joshi, H.C. Brominated derivatives of noscapine are potent microtubule-interfering agents that perturb mitosis and inhibit cell proliferation. Mol. Pharmacol. (2003) 63(4): 799-807.

۳۴.     Zhou, J.; Gupta, K.; Yao, J.; Ye, K.; Panda, D.; Ginnakakaou, P. and Joshi, H.C. Paclitaxel-resistant human ovarian cancer cells undergo C-Jun NH2-terminal kinase-mediated apoptosis in response to noscapine. J. Biol. Chem (2002) 277(42): 39777-39785.

۳۵.     Joshi, H.C. and Zhou, J. Noscapine and analogoues as potential chemotherapeutic agents. Drug New Perspect. (2000) 13(9): 543-546.

۳۶.     Ke, Y.; Ye, K.; Grossnikaus, H.E.; Archer D.R.; Joshi, H.C. and Kapp, J.A. Noscapine inhibits tumor growth with little toxicity to normal tissues or inhibition of immune responses. Cancer-Immunol-Immunother. (2000) 49(4-5): 217-225.

۳۷.     Tsunoda, N. and Yoshimura, H. Metabolic fate of noscapine. III. Further studies on identification and determination of the metabolites. Xenbiotica (1981) 11(1): 23-32.

۳۸.     Tsai, C.; Perng, R.; Chang, K.; Venzo, D. and Gazdar, A. Evaluation of the relative cytoxic effects of anticancer agents in serum-Supplemented Versus Serum-free media using a tetrazolium colorimetric assay. Jpn. J. Cancer (1996) 87: 91-97.

۳۹.     Ian freshney, R. Culture of Animal Cells A Manual of Basic Technique (1992) 2nd edition P: 15-46.

۴۰.     Chollet, D.F.; Ruols, C. and Arnera, V. Determination of noscapine in human plasma using solid-phase extraction and high-performance liquid chromatography. J. of chromatography B (1997) 701: 81-85.

۴۱.     Lee, D.U. (-)- -Narcotine: A facile synthesis and degradation with ethyl chloroformate. Bull. Korean Chem. (2002) 23(11): 1548-1552.

۴۲.    Yin, C.; Tang, C. and Wu, X. HPLC determination of aminophylline, methoxy phenamine hydrochloride,  noscapine and chlorphenamine maleate in compound dosage forms with an aqueous-organic mobile phase. J. of Pharmaceutical and Biomedical Analysis (2003) 33: 39-43.

۴۳.     Musshoff, F.; Trafkowski, J. and Madea, B. Validated assay for the determination of markers of illicit heroin in urine samples for the control of patients in a heroin prescription program. J. of chromatography B (2004) 811: 47-52.

۴۴.     Johansson, M.; Tufvesson, A.; Forsmo-Bruce, H.; Jacobsso, S. and Westerlund, D. Determination of noscapine and its metabolites in plasma by coupled-column liquid chromatography. J. of chromatography (1988) 459: 301-311.

۴۵.     Kikura-Hanajir, R.; Kaniwa, N.; Ishibashi, M.; Makino, Y. and Kojima, S. Liquid chromatographic-atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometric analysis of opiates and metabolites in rat urine ofter inhalation of opium. J. of chromatography B (2003) 789: 139-150.